小鼠前列腺腫瘤組織屬于致密、纖維含量高的類型樣品。手動(dòng)研磨特別考驗(yàn)手法；這次我們應(yīng)用機(jī)器自動(dòng)化解離，看看這處理效果到底能不能打——實(shí)驗(yàn)全程使用上海凈信JX-DLDXB-4單細(xì)胞懸液制備儀。
實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備
1. 樣本：小鼠前列腺腫瘤組織，約100mg。腫瘤組織比正常組織更致密，剪塊的時(shí)候盡量切小一點(diǎn)，別整塊往里塞，不然解離效率會(huì)受影響。
2. 試劑：配套單細(xì)胞懸液制備試劑盒。試劑盒必須放在低溫保存，做實(shí)驗(yàn)前提前拿出來(lái)解凍，千萬(wàn)別臨時(shí)抱佛腳。試劑盒里一般包含消化酶和緩沖液，按說(shuō)明書比例配好就行。
3. 耗材：手術(shù)剪刀、眼科鑷、培養(yǎng)皿、移液槍、離心管、濾網(wǎng)。
4. 實(shí)驗(yàn)儀器：凈信JX-DLDXB-4單細(xì)胞懸液制備儀。這款機(jī)器是四通道設(shè)計(jì)，可以同時(shí)處理多個(gè)樣本，通量不錯(cuò)。儀器自帶幾種預(yù)設(shè)程序，針對(duì)不同的組織類型做了優(yōu)化，可以直接調(diào)用，不用自己從零摸索參數(shù)。
小鼠腫瘤組織單細(xì)胞懸液制備的實(shí)驗(yàn)操作步驟
整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程其實(shí)不復(fù)雜，我這次用的是儀器內(nèi)置的"小鼠腫瘤程序1"，具體流程如下：
1. 樣本處理：先把小鼠前列腺腫瘤組織取出來(lái)，放在培養(yǎng)皿里，用手術(shù)剪刀剪成小塊。這一步越碎越好，但也不用太強(qiáng)迫癥，機(jī)器后面還有機(jī)械解離，主要讓消化酶能充分滲透進(jìn)去就行。剪完后轉(zhuǎn)移到消化管中，加入配好的消化酶混合液。
2. 上機(jī)解離：將消化管裝入儀器的固定槽位，確認(rèn)管蓋卡緊。在觸摸屏上選擇"小鼠腫瘤程序1"，這個(gè)程序的溫度和轉(zhuǎn)速曲線是針對(duì)腫瘤組織優(yōu)化過(guò)的，不用自己調(diào)。點(diǎn)開(kāi)始后機(jī)器會(huì)自動(dòng)升溫，然后進(jìn)行恒溫酶解，同時(shí)伴隨機(jī)械震蕩，讓組織在酶和機(jī)械力的雙重作用下逐漸打散。
3. 過(guò)濾與清洗：解離完成后取出消化管，先用移液槍輕輕吹打幾下，把管壁上粘的細(xì)胞沖下來(lái)。然后用細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，把沒(méi)解離開(kāi)的組織碎片和細(xì)胞團(tuán)塊篩掉。過(guò)濾后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，低速離心清洗，去掉多余的消化酶和碎片。
4. 重懸與計(jì)數(shù)：清洗后的細(xì)胞沉淀用PBS或培養(yǎng)基重懸，輕輕吹打混勻。然后用血球計(jì)數(shù)板或者自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)一下濃度和活率，確保后續(xù)上流式的細(xì)胞數(shù)量夠用。活率一般要在85%以上，太低的話分選效果會(huì)打折扣。
單細(xì)胞懸液制備過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
做下來(lái)有幾個(gè)地方容易翻車，需要提前避一下雷：
1. 試劑盒保存和解凍：試劑盒一定要低溫凍存，不能反復(fù)凍融。建議提前一晚放到4℃解凍，或者實(shí)驗(yàn)當(dāng)天拿出來(lái)室溫化凍。反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致酶活性下降，解離效果直接打折扣。
2. 組織塊大小：別嫌麻煩，組織塊一定要剪碎。大塊組織進(jìn)去，機(jī)器再?gòu)?qiáng)也啃不動(dòng)，最后過(guò)濾時(shí)堵濾網(wǎng)，細(xì)胞得率低，還耽誤時(shí)間。
3. 清洗要克制：清洗是為了去掉碎片和殘留酶，但次數(shù)太多會(huì)損失細(xì)胞。尤其腫瘤組織解離出來(lái)的細(xì)胞相對(duì)脆弱，離心轉(zhuǎn)速過(guò)高或者時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂。
4. 程序選擇：JX-DLDXB-4單細(xì)胞制備儀內(nèi)置了多種程序，對(duì)應(yīng)不同組織類型。小鼠腫瘤樣本就用"小鼠腫瘤程序1"，別套用其他程序。程序內(nèi)部參數(shù)包括溫度曲線、振蕩頻率、時(shí)間都是匹配好的，自己亂調(diào)反而容易出問(wèn)題。
結(jié)果總結(jié)
這次實(shí)驗(yàn)用機(jī)器解離下來(lái)的細(xì)胞懸液，整體狀態(tài)比我之前手動(dòng)研磨的要均勻很多。細(xì)胞得率穩(wěn)定，碎片率明顯降低，最重要的是重復(fù)性好。手動(dòng)研磨每次結(jié)果波動(dòng)挺大，全看手感和運(yùn)氣，機(jī)器做完幾次，數(shù)據(jù)之間的偏差小了很多，后續(xù)上流式分選也省了不少心。
上海凈信JX-DLDXB-4單細(xì)胞懸液制備儀，對(duì)于前列腺腫瘤這種致密組織，解離效率確實(shí)在線。預(yù)設(shè)程序省掉了調(diào)參的時(shí)間，四通道并行處理，通量也夠用。如果你實(shí)驗(yàn)室也做小鼠腫瘤組織的單細(xì)胞解離，這臺(tái)機(jī)器可以列入考慮清單，至少能把重復(fù)性差這個(gè)老大難問(wèn)題給解決掉。
